本產(chǎn)品用于定性分析人體活檢切片組織中C4d在腎小管周毛細(xì)血管的沉積
Anti C4d(BI-RC4D)
規(guī)格： 250μl/每瓶
形式： 液體IgG 片段，蛋白G 層析法純化
應(yīng)用： 人組織石蠟和冰凍 切片
Anti C4d, FITC
規(guī)格：100μl/每瓶
形式: 液體IgG 片段，蛋白G 層析法純化
應(yīng)用： 流式細(xì)胞術(shù)
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
C4d多克隆抗體
可同時(shí)作用于石蠟切片和冰凍切片上
臨床檢測(cè)意義
C4d 在腎小管周毛細(xì)血管的沉積可作為診斷抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)的重要依據(jù)，是抗體介導(dǎo)的移植腎損傷的標(biāo)志，與移植腎的預(yù)后相關(guān)，是腎失功獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。
受者人體循環(huán)中同種抗體和移植的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合是首要目標(biāo)�；畹膬�(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)帽化，脫落與 內(nèi)化快速消除來(lái)自細(xì)胞表層的結(jié)合抗體。
C4d 是補(bǔ)體因子C4激活后的裂解片段，是經(jīng)典補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的成分，通過(guò)抗體與特異性的目標(biāo)分子 結(jié)合而啟動(dòng)。C4d檢測(cè)被看做是抗體排斥同種移植反應(yīng)的間接印證或者印記。在大多的文獻(xiàn)中都將 C4d看做是腎臟，心臟， 肝臟以及其他移植中的重要的指標(biāo)。
移植腎中急性抗體介導(dǎo)排斥的鑒定
1. 腎小球 C4d 沉積可先于局灶節(jié)段性腎小球硬化的發(fā)展 van de Lest et al., Kidney Int, 2019; 96(3):738-749.
2. “腎小球 C4d 沉積可先于 FSGS 的發(fā)展，這表明補(bǔ)體激活可能在 FSGS 的發(fā)展中發(fā)揮致病作用。” C4d 在腎移植受者活檢組織中的重要性。 Corrêa, Clin Develop Immun, 2013; 2013:678180.
3. “對(duì)活檢標(biāo)本中 C4d 染色呈陽(yáng)性的 AMR 進(jìn)行進(jìn)一步研究，以及對(duì)可能參 與這一過(guò)程發(fā)病機(jī)制的新型常規(guī)標(biāo)志物的研究都非常重要。” 患有急性 T 細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的腎移植受者對(duì)治療的反應(yīng)和長(zhǎng)期結(jié)果 Bouatou et al., Am J Transplant, 2019; 19(7):1972-1988. “因此，對(duì)急性 TCMR 治療反應(yīng)的臨床、組織學(xué)和免疫學(xué)評(píng)估揭示了對(duì)治療 反應(yīng)的不同特征，具有不同的結(jié)果�！�
采樣及送檢方式
醫(yī)生從患者體內(nèi)切取，鉗取或穿刺取出病變組織，制作成石蠟或冰凍切片
工作步驟
抗C4d 抗體，石蠟切片（4.5%中性緩沖液福爾馬林固定），免疫組化法
1 .切片脫蠟及水化
2 .抗原修復(fù)，在125℃TRIS/EDTA修復(fù)液(PH8.5) 中高壓5min,冷卻20min至室溫。 TRIS/EDTA緩沖液：10ml 1M TRIS(ph9)+20ml 0.05M EDTA(ph7.5)+970ml H
2Obidest
3.PBS 沖洗
4 .PBS 配制3% H
2O
2 對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行封閉 10min
5. PBS 沖洗
6 .滴加UltraVsion Block 孵育5min
7 .PBS 沖洗
8. 滴加抗C4d抗體，用PBS-BSA(1%BSA)1：30-1：50稀釋，室溫下孵育60min
9. PBS 沖洗
10. 滴加Primary Antibody Enhancer， 在室溫下孵育20min
11. PBS 沖洗
12.滴加HRP Polymer(酶標(biāo)二抗)，在室溫下孵育30min
13. PBS 沖洗
14. DAB 或AEC 顯色劑顯色（根據(jù)染色深淺調(diào)整時(shí)間）
15. 水龍頭水沖洗10min
16. Mayer 蘇木精復(fù)染 1min
17. 水溶性封片劑封片
抗C4d抗體， 冰凍切片， 間接免疫熒光法
1. 冰凍切片在用PBS 1:20-1:30 稀釋兔抗C4d多克隆抗體液中室溫下孵育 30min，
2.PBS 沖洗4次
3. 用FITC 標(biāo)記二抗兔抗C4d抗體（根據(jù)供應(yīng)商提供比例稀釋），之后孵育檢測(cè)結(jié)合的抗體
4. PBS 沖洗4次
5. 水溶性封片劑封片
Frequently asked questions 常見(jiàn)問(wèn)題
1. 對(duì)于C4d多克隆抗體，應(yīng)當(dāng)使用什么作為陽(yáng)性控制？最好的陽(yáng)性控制是有抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)的病例。證明抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)最理想的就是來(lái)自同一樣品的冰凍切片上的陽(yáng)性C4染色�；蛘呤怯锌贵w介導(dǎo)排斥反應(yīng)典型臨床表現(xiàn)且被Luminex技術(shù)證明或傳統(tǒng)交叉配型測(cè)試過(guò)的供者特異性抗體病例也可以
如果沒(méi)有明確的體液排斥反應(yīng)可以作為陽(yáng)性控制，你可以使用膜性腎小球腎炎（自體腎或者TX）切片, C4d將會(huì)沿著腎小球基底膜（GBM Fig 1A）產(chǎn)生一個(gè)顆粒狀的染色模式，幾乎同由IgG(Fig 1B)產(chǎn)生的染色模式一樣. 有必要多測(cè)試幾個(gè)病例因?yàn)檠a(bǔ)體成分經(jīng)典途徑產(chǎn)生的沉積物在MGN(膜性腎小球腎炎)中是易變的。
2. C4d診斷相關(guān)的染色模式是什么？
抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)唯一的診斷相關(guān)的染色模式是沿著管周毛細(xì)血管（PTH Fig2A）的線性C4d沉積物.在最近的一項(xiàng)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)在管周毛細(xì)血管中不連續(xù)的粗糙顆粒狀的典型的病灶染色模式與抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)沒(méi)有關(guān)聯(lián)性。
3. C4d 沉積物在其他位置有什么意義？
C4d沉積物在腎臟的不同腔室都可以發(fā)現(xiàn)。總的來(lái)說(shuō)非管周毛細(xì)血管對(duì)抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)沒(méi)有診斷的相關(guān)性（除了腎小球內(nèi)皮細(xì)胞染色 Fig 3A）. 在動(dòng)脈和小動(dòng)脈壁上（Fig 2C, 箭頭跟三角形）很常見(jiàn)的可看到多變數(shù)量的C4d。例如在免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球腎炎匹配的其他補(bǔ)體（Fig 2D，箭頭和三角形）的分配與模式這樣許多的例子中可以找到腎小球C4d沉積物。此外在慢性移植腎小球病中也會(huì)發(fā)現(xiàn)腎小球C4d 沉積物。腎小球病中的C4d染色很明顯的會(huì)影響大部分甚至整個(gè)毛細(xì)血管壁（對(duì)比在一些抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)病例中發(fā)現(xiàn)的官腔型內(nèi)皮細(xì)胞染色模式）。腎小球病中的腎小球毛細(xì)血管壁染色模式經(jīng)常會(huì)聯(lián)想到在有內(nèi)皮沉積物的免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球腎炎中觀察到的染色模式。在很多病例中，其他補(bǔ)體成分的免疫組化和免疫球蛋白需要作出可靠的有差別的診斷。
4. C4d 多克隆抗體是否適用在免疫熒光法的冰凍切片上？
是，C4d 多克隆抗體可以用在冰凍切片上，且染色結(jié)果等同于單克隆抗C4d抗體中觀察到的模式，但單克隆抗C4d抗體不適用與石蠟切片。
5. 理想的染色步驟是什么？
每個(gè)實(shí)驗(yàn)室本身可以判斷何為理想的染色步驟。合理的是要從供應(yīng)商提供的C4d抗體開(kāi)始染色步驟。熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)在大多實(shí)驗(yàn)室中都是必須的。一些公司會(huì)發(fā)現(xiàn)高壓修復(fù)要優(yōu)于微波修復(fù)。因?yàn)楹笳邥?huì)造成敏感性降低。但是這和其他染色細(xì)節(jié)仍然需要測(cè)試和根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況去調(diào)節(jié)。
6. 石蠟切片免疫組化的敏感度等同于冰凍切片免疫發(fā)光的敏感度嗎？
通過(guò)一些專門解決這個(gè)問(wèn)題的研究得出結(jié)論：冰凍切片免疫熒光法總的來(lái)說(shuō)比石蠟切片免疫組化的敏感度高。考慮這個(gè)情況，Banff 分類
7. 如果不能對(duì)切片采取高壓處理，是否有其他的方法處理切片？
其他的方法就是用微波修復(fù)抗原，由于我們對(duì)此種方法沒(méi)有驗(yàn)證過(guò)，客戶可以嘗試不同抗體稀釋方法來(lái)驗(yàn)證非特異性結(jié)合。
8. 工作步驟上面的參考信息是否使用抗體
所引用的參考信息的確使用了那種抗體。請(qǐng)看Link Literature Reference 或咨詢客服專員索取信息。
9. IgG的濃度是什么？
0.2mg/ml,純IgG,通過(guò)蛋白質(zhì)G純化， 無(wú)載體蛋白
10. 工作步驟中所給出的PBS 緩沖液僅僅就只是純PBS緩沖液?jiǎn)�？是否包含BSA 或者一些蛋白質(zhì)在里面？
緩沖液只是純的PBS 溶液 10mM/PBS/140Mm NaCI ph7
11. 抗體是否會(huì)和狗發(fā)生交叉反應(yīng)？
總的來(lái)說(shuō)C4d的活性在哺乳類的物種中比較保守。所以有很大的可能性在狗身上也會(huì)發(fā)現(xiàn)C4d.目前對(duì)于跟狗的交叉性反應(yīng)還不清楚。
12. H2O2 封閉液是使用Superstain 還是其他的？
30% Fluka Hydrogen peroxide ,1:10 甲醛稀釋，室溫下10min(最終濃度3%)
13. 工作步驟上指出要用20mM的PBS—配方是什么？
20mMPBS 溶液要準(zhǔn)備200mM的原液
A: 5.244g NaH2PO4x1H2O+大概190ml aqua bidest, PH=7.4
B:28.83g Na2HPO4x2H2O+大概810ml aqua bidest, PH=7.4
混合A和B,PH控制7.4， 添加到1L工作液中， 在0.9% NaCi中稀釋原液1:10
14. 用Harris 蘇木精復(fù)染會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題嗎？
用Harris 蘇木精復(fù)染不會(huì)有問(wèn)題。反應(yīng)產(chǎn)品穩(wěn)定， 你需要相應(yīng)的優(yōu)化復(fù)染時(shí)間（使用你常用的石蠟切片）
15. 有沒(méi)有可能每次沖洗5min?
是，最少要5min的沖洗時(shí)間。 你應(yīng)當(dāng)更換PBS溶液4次。
參考文獻(xiàn)
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本品僅用于科研。
